Ricercatori olandesi combinano CRISPR e bioluminescenza in un test sperimentalemalattie infettive

Secondo ricercatori olandesi, una proteina notturna di recente sviluppo potrebbe accelerare e semplificare la diagnosi delle malattie virali.
Il loro studio, pubblicato mercoledì su ACS Publications, descrive un metodo sensibile e in un unico passaggio per analizzare rapidamente gli acidi nucleici virali e il loro aspetto utilizzando proteine ​​blu o verdi luminose.
L’identificazione degli agenti patogeni rilevando le impronte digitali degli acidi nucleici è una strategia chiave nella diagnostica clinica, nella ricerca biomedica e nel monitoraggio della sicurezza alimentare e ambientale.I test quantitativi di reazione a catena della polimerasi (PCR) ampiamente utilizzati sono altamente sensibili, ma richiedono una sofisticata preparazione dei campioni o un'interpretazione dei risultati, rendendoli poco pratici per alcuni contesti sanitari o contesti con risorse limitate.
Questo gruppo olandese è il risultato di una collaborazione tra scienziati di università e ospedali per sviluppare un metodo diagnostico degli acidi nucleici veloce, portatile e facile da usare che può essere applicato in una varietà di contesti.
Sono stati ispirati dai lampi delle lucciole, dai bagliori delle lucciole e dalle piccole stelle del fitoplancton acquatico, il tutto alimentato da un fenomeno chiamato bioluminescenza.Questo effetto luminoso al buio è causato da una reazione chimica che coinvolge la proteina luciferasi.Gli scienziati hanno incorporato le proteine ​​luciferasi nei sensori che emettono luce per facilitare l'osservazione quando trovano un bersaglio.Sebbene ciò renda questi sensori ideali per il rilevamento nei punti di cura, attualmente non hanno l’elevata sensibilità necessaria per i test diagnostici clinici.Sebbene il metodo di editing genetico CRISPR possa fornire questa funzionalità, richiede molti passaggi e apparecchiature specializzate aggiuntive per rilevare il segnale debole che può essere presente in campioni complessi e rumorosi.
I ricercatori hanno trovato un modo per combinare una proteina correlata a CRISPR con un segnale bioluminescente che può essere rilevato con una semplice fotocamera digitale.Per assicurarsi che ci fosse abbastanza campione di RNA o DNA per l'analisi, i ricercatori hanno eseguito l'amplificazione della polimerasi ricombinasi (RPA), una tecnica semplice che opera a una temperatura costante di circa 100°F.Hanno sviluppato una nuova piattaforma chiamata Luminescent Nucleic Acid Sensor (LUNAS), in cui le due proteine ​​CRISPR/Cas9 sono specifiche per diverse porzioni contigue del genoma virale, ciascuna con un frammento unico di luciferasi attaccato sopra.
Quando è presente il genoma virale specifico che i ricercatori stanno esaminando, due proteine ​​CRISPR/Cas9 si legano alla sequenza dell'acido nucleico bersaglio;diventano molto vicini, consentendo alla proteina luciferasi intatta di formarsi ed emettere luce blu in presenza di un substrato chimico..Per tenere conto del substrato consumato in questo processo, i ricercatori hanno utilizzato una reazione di controllo che emetteva luce verde.Una provetta che cambia colore da verde a blu indica un risultato positivo.
I ricercatori hanno testato la loro piattaforma sviluppando il test RPA-LUNAS, che rilevaRNA della SARS-CoV-2senza noioso isolamento dell'RNA e ha dimostrato le sue prestazioni diagnostiche su campioni di tampone nasofaringeo provenienti daCOVID 19pazienti.RPA-LUNAS ha rilevato con successo SARS-CoV-2 entro 20 minuti in campioni con una carica virale di RNA pari a 200 copie/μL.
I ricercatori ritengono che il loro test possa rilevare facilmente ed efficacemente molti altri virus."RPA-LUNAS è interessante per i test sulle malattie infettive presso i centri di cura", hanno scritto.